不同水稻品种开花后剑叶RUBISCO稳定性研究

【摘要】Rubisco(核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶,EC4.1.1.39)是一个双功能酶,既可以催化卡尔文循环中CO2的固定,又参与C3植物的光呼吸过程。高等植物的Rubisco的含量和活性决定光合作用功能并与基因型及生长条件密切相关,影响产量与品质的形成。植物Rubisco由大、小亚基组成,在不利生长条件下易发生结构解体。水稻剑叶是籽粒形成过程中光合产物供给的主要功能叶片,本研究试图从Rubisco含量、活性、基因表达、亚基蛋白表达、体外降解特征等几个方面对不同基因型的Rubisco的稳定性差异进行动态分析,以期为水稻Rubisco的功能稳定性评价、育种与栽培提供遗传生理依据。本研究选取日本晴(Nippobare)、N22、R49、ITA312四个水稻品种,对其灌浆过程的不同时期(花后5d、10d、15d和20d)剑叶的光合生理指标、Rubisco酶活性、Rubisco大亚基和小亚基基因(rbcL和rbcS)转录表达、Rubisco大亚基蛋白表达的动态变化进行了测定,并对Rubisco酶的体外降解条件进行了初步探索。主要研究结果如下：1.Nippobare、N22、R49和ITA312四个品种的叶绿素含量、净光合速率(Pn)、Rubisco活性在开花后5—20d阶段大致呈下降变化趋势,其变化幅度品种之间存在差异。Rubisco含量、Rubisco初始活力、Pn两两相关性均达0.9以上,且存在品种间差异,Nippobare的三个指标的相关性较好。2.Rubisco大、小亚基基因表达趋势一致,花后5—15d表达量增加,15d时达到最高,而后下降；而Rubisco含量在品种Nippobare和R49中逐渐下降,N22和ITA312中先升后降,在花后10d达到最大值。Rubisco基因表达与Rubisco含量趋势不一致,推测Rubisco基因的转录和翻译不同步所致,也可能与品种及其对氮需求水平差异有关。rca在花后5d—10d上升表达,花后10d时达到最大表达量,而酶活性最高多发生在花后5d时,可能由于Rubisco酶含量在第5d时有最大值而含量是决定活性的关键所导致的。3.利用在线软件对rbcL氨基酸序列(GenBankAccession:P0C510)进行抗原决定簇预测并结合特性分析选择一段有效的抗原多肽序列,成功制备了具有高效价的Rubisco大亚基特异抗体(anti-rbcL)。WesternBlot实验结果表明,Nippobare和R49的Rubisco大亚基含量呈下降趋势,而N22和ITA312先升后降,与Rubisco含量测定结果趋势一致。根据多序列比对结果可知,本抗体可应用于小麦、油菜、玉米等Rubisco大亚基含量变化的检测,并且得以验证。4.Rubisco体外降解实验,选取Nippobare、R49、ITA312花后20d剑叶Rubisco粗酶液在33℃、pH5.0或5.5条件下处理0-4h,Rubisco发生降解,且随着时间的延长,降解越明显；20-50℃、pH5.0或5.5条件下处理2h,降解程度各异,在30-35℃时降解最为明显,超过45℃时Rubisco大亚基绝大部分降解了或未发生降解。SDS-PAGE和WesternBlot结果显示Nippobare和ITA312的Rubisco大亚基较R49的更为稳定。研究水稻Rubisco降解条件为进一步研究水稻Rubisco对蛋白水解酶的敏感性奠定了基础。本结果中Rubisco大亚基的基因和蛋白表达水平可作为评价水稻叶片光合功能的重要参考指标,所制备的rbcL抗体能快速准确检测水稻及、小麦、油菜和玉米的Rubisco大亚基蛋白水平,具有实用价值。
【作者】唐红玲；
【导师】曾汉来；
【作者基本信息】华中农业大学，作物栽培学与耕作学，2014，硕士
【关键词】水稻剑叶；Rubisco；基因表达；anti-rbcL抗体；体外降解；

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